1、流動相

（1）流動相中有機溶劑的類型和比例，會影響色譜分離的選擇性。對于反相色譜模式，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈和*。可以通過改變流動相中的有機相種類或調(diào)整其比例，來改變選擇性和分離度。

（2）流動相的pH值影響分離度。對于中性的化合物，流動相pH值的改變不會對其選擇性有太大的影響；對于酸性化合物和堿性化合物(可解離的化合物)，影響較大。

（3）可以通過添加緩沖鹽來調(diào)整流動相的離子強度，來改善目標化合物與固定相之間的保留。

2、固定相

固定相中鍵合相的類型，填料的孔徑，封端類型以及色譜柱的粒徑和尺寸都會影響色譜分離的結(jié)果。其中最主要的因素是鍵合相的選擇。當你采用C18固定相無法得到好的分離結(jié)果，可以考慮極性較強的C8固定相，或者選擇性與其有較大差異的苯基己基柱進行嘗試，或者采用封端的色譜柱代替未封端的色譜柱。

3、硬件系統(tǒng)

對硬件系統(tǒng)的一些參數(shù)進行調(diào)整，也可以在一定程度上改善色譜分離的結(jié)果。比如較高的采樣速率；采用較小內(nèi)徑的管線和較小的流通池來減小擴散體積和延遲體積減小色譜峰的展寬；或者通過提高色譜柱的柱溫來改善分離度。

1、所有組分響應都發(fā)生了大致相同程度的改變，可能的原因

（1）進樣問題：檢查樣品瓶和進樣針，保證樣品濃度和進樣體積沒有變化。

（2）檢測器問題：檢查檢測器所有參數(shù)設置，如果基線噪音很大，通常不是檢測器而是系統(tǒng)污染了。

（3）該組分結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定，進樣過程中可能降解。

（4）色譜條件是否發(fā)生改變，如流動相比例、pH 值等。

（5）色譜柱改變，選擇性改變，效應值也會發(fā)生改變。 

2、只有部分組分響應下降了

（1）看一看它們是否相似的揮發(fā)性或官能團，針對不同類型的樣品，盤查的角度可以有所不同：具有極性官能團（如-OH, -NH, -SH）的樣品易被吸附，對污染的系統(tǒng)進行簡單的維護。

（2）這些成分性質(zhì)是否穩(wěn)定，檢測過程中是否發(fā)生降解。 

導致這種結(jié)果的原因有很多：

如果樣品穩(wěn)定的話，首先排除儀器的故障，有氣泡是最主要的一種，氣泡的產(chǎn)生會導致進樣之間體積的不規(guī)律變化。

如果樣品之間的濃度相差很大，而進樣2-3針后同一個峰的峰面積保持不變，那么可能是樣品殘留。

峰面積的減少也有可能是溫度引起的，但是這個影響很小，小于2%。如果你把樣品從冰箱里拿出來放到進樣器里，它會慢慢的升溫，體積就會變大。這樣前后的進樣體積就有差別了。

流速的隨機變化也會導致峰面積變化。流速改變的另一個潛在原因是系統(tǒng)高壓部位漏液了，這個應該很容易發(fā)現(xiàn)。

復雜樣品中如果有肩峰（與目標峰局部分離），軟件就很難判斷基線在哪里。這時采用手動積分或者用強制基線自動積分將會改善積分的重現(xiàn)性。樣品本身也會造成峰面積變化。在反相色譜中發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)在開始的梯度中不能*洗脫，殘留的會出現(xiàn)在接下來的空白梯度中。這些鬼峰只在特定的蛋白質(zhì)和洗脫程序中出現(xiàn)。如果是這樣，就要在分析樣品后添加空白。另外，蛋白質(zhì)會不可逆的黏附在有些柱子內(nèi)，隨著進樣的增加，樣品的峰面積會慢慢變大。

壓力波動是在日常工作中常常遇到的問題，通常來說，壓力波動與色譜柱的關(guān)系并不大，主要是儀器系統(tǒng)的問題，下面兩點zui值得注意：

1、泵內(nèi)有氣泡；

2、單向閥或密封墊滲漏。

解決的途徑如下：

1、溶劑過濾后超聲脫氣；使用在線脫氣機；打開purge閥排氣泡，或者在溶劑中充氦氣；

2、清洗更換單向閥；更換泵密封墊。

1、短期保存色譜柱

反相柱：使用緩沖液或含緩沖鹽的流動相，實驗完成后應用20-30柱體積的甲醇或乙腈和水的10：90混合物進行沖洗，在用甲醇或乙腈和水的90：10混合物進行沖洗。如需過夜保存，可將流速保持在0.1到0.2mL/min。

正相柱：用流動相洗出樣品，再用高比例正己烷：異丙醇沖洗色譜柱，保存。

2、保存色譜柱如色譜柱要長時間保存

必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮hua鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。特殊類型色譜柱的儲存，需參考色譜柱說明書，使用廠商推薦的溶劑。 

1、流速降低

檢查并重新設置流速；檢查泵是否有氣泡；檢查泵密封墊是否滲漏，以及單向閥和其它系統(tǒng)滲漏。

2、流動相組成改變

檢查系統(tǒng)是否有漏液點；排除系統(tǒng)氣泡；補足溶劑瓶；確保梯度系統(tǒng)比例正確；預混合流動相進行等梯度洗脫；流動相組成的問題。在反相色譜中，保留因子k和流動相中有機相的比例是成指數(shù)關(guān)系的。通常，有機相變化1%，保留時間會變化5%-15%，一般是10%。pH變化0.1會導致保留時間變化10%，所以要準確的測量pH，并且要校正好pH計，在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；離子對試劑的濃度會影響離子型化合物組分的保留時間。帶有和離子對試劑相反電荷的分析物的保留時間會縮短，帶同樣電荷的會延長。正相色譜的保留時間對流動相中的極性成分非常敏感，任何情況下水都是一個麻煩，使用半飽和水的非極性溶劑比如正己烷和二氯甲烷來避免這個問題。

3、鍵合相流失

對于常用硅膠型色譜柱，要保持流動相pH2~8之間；對于*pH（>10）或極低pH（<2）的工作，使用高穩(wěn)定性固定相，聚合物或高穩(wěn)定性固定相柱。

4、硅膠填料的活化位點

使用流動相改性劑;流動相中加競爭堿;固定相用更高覆蓋度的填充料。

5、溫度降低

控制柱溫。通常溫度每變化1℃保留時間變化1%-2%。一般情況下影響沒有那么大，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。

1、色譜柱填料的活性位點

使用流動相改性劑，競爭堿（堿性化合物，如三乙胺）或增加緩沖液強度，使用高覆蓋率的柱填料。

2、流動相組成改變

檢查系統(tǒng)是否有漏液點；排除系統(tǒng)氣泡；補足溶劑瓶；確保梯度系統(tǒng)比例正確；預混合流動相進行等梯度洗脫。

3、樣品過載 

減少樣品量或使用較大內(nèi)徑或更長的色譜柱。

4、鍵合相或硅膠基流失 

使用溫和pH的流動相；使用耐受高pH或低pH專用硅膠柱，聚合物柱或其它高/低pH柱。

5、 色譜柱老化

使用保護柱，或高穩(wěn)定性鍵合相聚合物、混合型或高穩(wěn)定性柱。

1、液相系統(tǒng)沒有平衡好，柱子里的流動相一直在變化，導致基線波動；

2、沒有脫氣機的儀器，當流動相未脫氣或脫氣未*時，基線會出現(xiàn)尖刺峰；

3、當色譜柱被污染時，也會造成基線波動；

4、檢測器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此時需要清洗流通池；

5、檢測器燈能量不足時，吸收會變得不穩(wěn)定，這時基線一般也不穩(wěn)定，特別是在低波長處尤為明顯；

6、當使用低波長檢測時，有時流動相會使用兩相或以上的等度，這時混合器的很小的混合比例的誤差都會被放大，很有可能會使基線發(fā)生波動；

7、流動相里的有機相的截止波長最好要小于檢測波長20nm以上；

8、實驗室環(huán)境不穩(wěn)定（比如溫度忽高忽低，氣流不斷變化等）；

9、儀器出現(xiàn)問題也會造成基線波動，這種情況下通常也會出現(xiàn)壓力不穩(wěn)。比如流動相過濾頭堵塞、入口主動閥濾芯污染、單向閥被污染物堵塞、泵頭有氣泡、系統(tǒng)流路漏液，比如管路裂開、peek接頭沒*連上色譜柱而導致的泄露等。

色譜柱使用壽命大約為1000針，而保護柱的壽命大約為280針。主要受色譜條件及保存條件影響。表現(xiàn)形式：柱壓升高、柱效降低、峰形拖尾、峰形變寬、保留時間發(fā)生變化、固定相流失等。

1、色譜條件，有兩種基本情況：

（1）在相同實驗中，以前使用的色譜柱壽命長很多，這種情況，應該檢查一下色譜條件是否保持一致。樣品的組成，樣品中強吸收的污染物會破壞色譜柱的柱效?；蛘吖苈返拿芊馊κ欠裢旰?？脫落的密封圈會堵塞色譜柱過濾器和填料的頂層，從而影響樣品的分布。如果可以確認色譜條件沒有變化，那么可以推測是柱床松動的原因。在實驗室和運輸過程中色譜柱劇烈的震動都會導致柱床松動；

（2）在本實驗中用過的所有的色譜柱在使用相同次數(shù)后全部損壞，最大可能是樣品中的成分吸附在色譜柱的頂端。可能是在流動相中不溶的沉淀物或者是強吸收的物質(zhì)；

（3）采用合適的樣品準備技術(shù)處理樣品。用和分析柱相似的固相萃取柱進行固相萃?。⊿PE）；

（4）使用保護柱。保護柱是作為犧牲柱裝在色譜柱前使用的，出現(xiàn)問題的時候就會被替換掉。保護柱的填料和裝填技術(shù)必須和分析柱一樣；

（5）反沖柱子。反現(xiàn)在的裝填技術(shù)可以使柱子承受反沖，能更好的去除柱頭端的污染物。

2、使用方法不對，按照生產(chǎn)商的說明使用柱子的話一般很少發(fā)生

（1）流動相pH超出使用范圍，導致的柱子鍵和相水解或基質(zhì)溶解。樣品用強酸或強堿溶解的話也會發(fā)生；

（2）高溫也會導致色譜柱損壞，如高溫會加速鍵合相溶解；

（3）特殊柱子注意事項，例如氨基柱可以和醛，酮反應。氨基柱在不含緩沖鹽的水溶液中會顯強堿性，分解部分硅膠；

（4）暴露在錯誤溶劑中的柱子也會發(fā)生坍塌。因為這些柱子是基于非常松散的結(jié)構(gòu)。他們是因顆粒之間的黏著而部分的結(jié)合在一起的。如果置于能破化這種黏著的流動相中，柱床很有可能會坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有時就會發(fā)生這種問題。這也是不要沖洗柱子的另一個理由。 

1、色譜柱污染

在開始時沒問題，在使用一段時間后出現(xiàn)這個問題，可能是由于污染引起的。這時需要對色譜柱加強沖洗，即使用比方法流動相更強的溶劑沖洗色譜柱。

2、保護柱失效

如果樣品基質(zhì)比較臟，使用一段時間之后，發(fā)現(xiàn)的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護柱失效造成的。一般粗略判斷標準，塔板數(shù)、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護柱了。保護柱是消耗品，建議直接更換，不需要再生。

3、接頭連接不正確

如果色譜柱在使用過程中發(fā)現(xiàn)每個峰的峰形都出現(xiàn)問題，先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短，這種情況可能導致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當，將發(fā)生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會產(chǎn)生一段死空間，形成混合腔，導致柱外體積，使峰形變壞。

4、溶劑效應

在反相LC中、如使用100%有機溶劑或100%強溶劑，大體積進樣時，將使色譜峰過早洗脫出色譜柱，導致峰變形。進樣溶劑改為用水稀釋，與流動相更為兼容，即使進樣體積較大也不會出現(xiàn)峰變形。較早流出的峰或靠近溶劑前沿的峰更容易出現(xiàn)拖尾。在液相色譜中用溶于流動相的小體積進樣最為理想。

5、樣品過載

當進樣量超過柱子的容量，樣品峰會呈現(xiàn)分叉或拖尾，解決方案就是減少進樣量。

6、色譜柱塌陷

由于柱塌陷引起的峰分叉，很難修復。如果流動相pH>7或在色譜柱pH耐受圍臨界點附近長時間使用，是比較容易造成硅膠填料溶解塌陷。如果出現(xiàn)色譜柱塌陷，您會看到色譜圖中的每個峰峰形都會發(fā)生變化（峰拖尾、加寬或分叉），短時間內(nèi)可以反方向運行，建議直接更換色譜柱。日常使用的過程中注意將溫度降低到40℃以下，特別是使用高pH流動相時。

7、柱前篩板部分堵塞長期分析臟樣品

如果沒有保護柱或在線柱前過濾器，顆粒物和強吸附物很可能在柱入口篩板發(fā)生堵塞，同時伴隨著壓力升高，解決辦法一般是色譜柱反沖。

8、色譜柱性能下降

使用色譜柱時，會用其分析各種目標物、使用各種流動相并分離不同的樣品基質(zhì)，經(jīng)過長時間的使用，色譜柱會受到這些物質(zhì)的影響發(fā)生一些微妙的變化，從而引起峰分叉、拖尾或保留時間的改變。